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| 編輯推薦： |
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《微生物生理学实验教程》可作为高等院校微生物及相关专业的本科生和研究生的实验课教材，也可供相关教师及科研工作者参考。
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| 內容簡介： |
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《微生物生理学实验教程》共4章，30个实验。主要介绍研究微生物细胞化学成分、微生物细胞结构、微生物代谢与微生物代谢调控的实验技术和方法。《微生物生理学实验教程》选取的实验材料包括细菌、古菌、丝状真菌和酵母菌，生理类型包括白养型、异养型及光能营养型，实验技术则融合了微生物学、生物化学、遗传学、生物物理学、分子生物学、生物信息学等学科的研究技术和方法，力求综合分析和探讨微生物生命活动规律。《微生物生理学实验教程》选编的实验力求体现教材的基础性、代表性、实用性和先进性。《微生物生理学实验教程》对每个实验的实验原珥都作了较详细的论述，实验步骤清晰，每个实验都有思考题和参考文献。
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| 目錄：
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目录
总序
前言
第一章微生物细胞化学成分的分析1
实验一细菌细胞含水量与蛋白质含量的测定1
实验二细菌胞内辅酶I和辅酶Ⅱ浓度水平的检测10
实验三酵母菌细胞RNA提取与地衣酚测定法15
实验四法夫酵母菌细胞虾青素的提取及测定20
实验五极端嗜盐菌甘油二醚类衍生物的检测26
实验六真菌细胞中多糖成分的提取及单糖组分的测定32
第二章微生物细胞结构的分析39
实验七丝状真菌线粒体的提取及检测39
实验八酵母菌细胞壁的制备及多糖组分的检测44
实验九极端嗜盐菌紫膜的分离和提取51
实验十革兰氏阴性菌细胞壁外膜的分离和纯化58
第三章微生物代谢的分析61
实验十一翻转膜法测定细菌中的单价阳离子逆向转运蛋白活性61
实验十二根瘤菌接种豆科植物实验67
实验十三豆科植物根瘤菌共生体有效性测定71
实验十四反硝化细菌的培养及异化型硝酸盐还原作用的检测74
实验十五光合细菌的分离与纯化81
实验十六化能白养菌的分离与纯化88
实验十七微生物呼吸的测定96
实验十八乳酸发酵与乳酸茵饮料102
实验十九酒精发酵107
实验二十大肠杆菌细胞各组分中铁还原酶活性的检测109
实验二十一丝状真菌原生质体制备、融合及再生114
实验二十二细菌细胞内金属离子动态平衡的检测119
实验二十三葡萄糖苷酶BgIB在大肠杆菌中的异源表达、纯化124
实验二十四长侧翼同源区PCR法敲除枯草芽孢杆菌的目的基凶133
实验二十五环境样品宏基因组文库构建及功能基因的筛选139
实验二十六易错PCR致突变的反应体系设计与实验149
第四章微生物代谢调控的分析156
实验二十七深红红螺菌固氮酶合成和活性的调控及测定156
实验二十八培养条件对重组大肠杆菌生长及聚羟基烷酸产量和组成的影响163
实验二十九大肠杆菌p半乳糖苷酶的诱导合成和分解代谢物阻遏169
实验三十不同培养条件下细菌目的基因转录水平差异的分析174
附录l微生物细胞的收集和处理方法180
附录2利用KEGG数据库查询代谢途径信息简介182
附录3常见的市售酸碱的浓度188
附录4微生物生理学实验中常用的缓冲液和储存液的配制189
附录5极端嗜盐茵的种类及生理特征192
附录6离心机的转速、相对离心力和半径之间的换算关系194
附录7酸奶的检查指标195
附录8网筛的目数与孔径的关系196
附录9微生物的平板菌落计数法197
附录10微生物显微镜直接计数法198
图版
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第一章微生物细胞化学成分的分析
微生物细胞化学成分的分析是研究微生物生命活动的基础。本章介绍分析微生物细胞化学组成的方法，包括微生物细胞含水量、蛋白质、核糖核酸、糖类含量的则定方法，反映细菌细胞内氧化还原水平n勺辅酶I和辅酶II浓度的检测方法，极端耆盐菌细胞膜的独特成分甘汕二醚类的分析技术和次级代谢产物虾青素的提取及则定。
实验一细菌细胞含水量与蛋白质含量的测定
一、实验目的
1．掌握测定细菌细胞干重及含水量的原理及方法。
2．了解几种常用的测定蛋H质含量i向方法，掌握福林一酚法和考马斯亮蓝染色法测定细菌细胞蛋白质含最的原理及实验技术。
二、实验原理
（一）细菌细胞干重和含水量的测定
在液体培养基中培养的微生物细胞，经过滤或离心收集斤，洗涤除去附在细胞表面的培养基，再离心收集细胞，≥i：尽量除去细胞所附着的水分，称得的质量为细抱的鲜重wet weight，常以gL表示。为了防止细胞吸水涨裂，洗涤细胞常用与细抱基本等渗的缓冲液。由于细胞在收集过程中会聚集成团，细胞之问的水分难以除去，冈此，用上述方法测得的细胞鲜重常常比实际的鲜重要高（一般高出10%左右）。弛胞之问的水分可用加入同位素标记蛋白质测定，由蛋白质不能进入细胞，只能溶于细胞外围的水中，因此测定细胞团的放射活性，可推算出细胞外围的水量。
取一定量的鲜细胞，105～110℃干燥16 --24 h后称量，再重复儿次，称至恒重，得到细胞的干重（dry weight）。微生物细胞f向干重就是微生物的生物量biomass，是测量微生物生长的重要指标，常用每升含有微生物的质量（单位gL）表示。105～110℃足以挥发掉大分子通过水合作用所结合的水，更高的温度会引起某些大分子的玻坏并导致一些细胞其他成分的挥发。此外，高温也会引起细胞悬液沸腾，将物质溅出容器，而使结果偏低。
微生物生理学实验教程
用上述方法测干重的细胞，其中的生物大分子已失去了生物活性，如需保持细胞大分子的生物活性，可采用真空冷冻干燥的方法。真空冷冻干燥lyophilization是将待干燥的制品冷冻成固态，冉将冻结的制品经真空升华逐渐脱水而留下干物的过程，包括冻结、升华和再干燥。冷冻干燥由冷冻干燥机来完成，冷冻干燥的制品是存低温、高真空中制成的，由于微小冰晶体的升华呈现多孔结构，这样获得的细胞物质其生物活性不变。真空冷冻干燥的原理、特点、过程及真空冷冻干燥机的工作原理见实验五。
微生物细胞中含有大量的水，一般占细胞鲜重的70%～90%。细胞含水量water content的计算公式如下：
（二）细菌细胞蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定可根据其物理化学性质，采用物理方法如折射率、密度、紫外吸收等来测定，或用化学方法如凯氏定氮、双缩脲反应、福林 Folin．酚反应等方法来测定；还可用染色法如氨基黑、考马斯亮蓝染色来测定。其中紫外吸收法、双缩脲法、福林一酚试剂法、考马斯亮蓝染色法等最为常用，并日．操作简便，不需复杂和昂贵的设备，又能符合一般突验室的要求。
1．双缩脲法
两分子尿素在高温180。C卜^，释放一分子氨，缩合形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结合，生成复杂的紫红色化合物。蛋白质或二肽以上多肽分子中含多个与双缩脲结构相似肽键，也具有双缩脲反应。双缩脲反应仅与蛋白质的肽键结构有关，与蛋白质的氨基酸组成无关，不受蛋白质氨基酸组成差异的影响，反应所形成的紫红色化合物的颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的种类无关。
双缩脲的常虽法测定蛋白质的浓度为1～10 mgmL，选用540 nm比色。含有一个CSNH2、-CH7-NH2、-RHSNH2、CH7-NH-CHNH7-CH20H、CHOH-CH2NH2等基团的物质，含有氨基酸和多肽的缓冲液、Tris、蔗糖、甘油等物质干扰此反应。该法测定试剂简单，操作方便，适合蛋白质浓度的快速测定。硫酸铵不干扰显色反应，有利于二蛋白质纯化早期步骤的测定。
2．福林一酚法
福林Folin -酚法（也称为Lowry法）是常用的蛋白质定量测定方法之一。其显色原理包括两步反应：第一步是蛋白质发生双缩脲反应，第二步是酚试剂反座。福林．酚试剂由试剂甲和试剂乙组成。试剂甲由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，蛋白质中的肽键在碱性条件下与洒石酸钾钠一铜盐溶液作用，生成紫色的铜一蛋白质络合物；试剂乙由磷钼酸、磷钨酸、盐酸、溴等组成，在碱性条件下被第一步反应形成的铜一蛋白质络合物中的酪氨酸的酚基还原而呈蓝色，在‘定条件下，蓝色度与蛋白质含量成比例，此方法测定的是25～250 ligmL的蛋白质。
由于酚试剂依赖于酪氨酸、色氨酸等特定的氨基酸残基，冈此蛋白质的氨基酸组成不同会引起显色偏差，但双缩脲反应的加入使这种偏差相对减小，这是由于双缩脲反应仅与蛋白质中的肽键结构有关，不受蛋白质氨基酸组成的影响。这两种试剂的配合使用使其优势互补，达到最佳效果。该法测定蛋白质含黾的优点是操作简便、迅速，不需要特殊的仪器、设备，灵敏度比双缩脲法灵敏100倍。
由于福林一酚法包括双缩脲反应，因此，_T-扰双缩脲反应的试剂均可_T-扰福林一
酚反应。此外，样品中的酚类及柠檬酸也对此反应有干扰作用；而含量较低的尿素（0.5%左右）、胍（0.5%左右）、Na2S04 1%、NaN03 1%、三氯乙酸0.5%、乙醇 5%、乙醚5%、丙酮0.5%对显色无影响；这些物质的含量较高时，需作校正曲线。如果样品中含硫酸铵，需增加Na2C03-NaOH浓度即可显色测定。如果样品酸度较高，也需提高Na2C03-NaOH浓度1～2倍．可纠『F显色浅的弊病。
值得注意的是，福林．酚试剂乙在酸性pH条件下较稳定，而福林．酚试剂甲是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性l佝铜一蛋白质络合物溶液。当福林一酚试剂乙加入后，应立即混匀，以便存磷钼酸．磷钨酸试剂被破坏之前，使其与酪氨酸发生还原反应。
3．考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法（又称Bradford法）测定蛋白质浓度，是利用蛋白质与染料
结合的原理。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，颜色由红色变为蓝色，最大光吸收波长由465 nm变为595 nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律Beer''s law，通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合的蛋白质的量。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250的结合是一个快速的过程，2 min左右就可反应完全呈现最大光吸收，并可稳定th，之斤，蛋白质一染料复合物会发生聚合l叮沉淀。由于二蛋白质．染料复合物具有很高的消光系数，冈此，该法的灵敏度很高，比福林．酚法灵敏4倍，测定浓度为10--100ugmL蛋白质，微量测定法为1～10ugmL蛋白质。此方法重复性好，精确度高。
该方法干扰物步，NaCI、KCI、MgC12、乙醇、NH42S04均无干扰。强碱缓冲液的一些颜色干扰可通过适当的缓冲液的对照扣除。Tris、乙酸、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及微量的去污剂（Trition X-100、SDS、玻璃去污剂）有少量颜色T扰，用适当的缓冲液对照可以扣除，但大量去污剂的存在对颜色影响较大。
4BAC法
BAC是对一价铜离子敏感和高特异性的试剂
在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与二价铜离子生成络合物，同时将二价铜离子还原成一价铜离子。BCA可以特异地与一价铜离子结合，生成一个在562 nm处有最大光吸收的紫色复合物。在一定范同内，复合物的光吸收强度与蛋白质浓度成正比。此法测定10～1200 ligmL蛋白质。
BCA法操作简单，灵敏度与福林一酚法相似，但它与一价铜离子生成的化合物十分稳定，冈此，对反应时间的控制不需要太严格。蛋白质氨基酸组成的不同不会引起显色偏筹。试剂抗干扰能力强，SDS、Triton X-100、4 molL盐酸胍、3 molL尿素均无影响。
5．紫外吸收法
由于蛋白质分子中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香环结构中含有共轭双键，由此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收峰在280 nm处。在此波长下，蛋白质溶液的吸光值与其含量成正比关系，可用作定量测定。测定范围0.1～1.0 mg。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品。此法的缺点是：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质（如核苷酸、核酸），舍出现较大十扰。
虽然蛋白质含量测定的方法很多，但各方法均有它的可用性，又有它的局限性。因此，要根据实验的需求来选择。例如，柱层析要求随时、快速检测蛋白质的分离情况，不丢失样品，但准确度要求不高，所以用紫外分光光度法。双缩脲法线性关系好，但灵敏度差，测量范围窄。福林一酚法弥补了双缩脲法的缺点，应用广泛，但它的干扰因素多，因而出现了考马斯亮蓝染色法。BCA法干扰因素少，试剂稳定，灵敏度与福林一酚法相似。
总之，在微生物生理学实验中，经常要测定蛋白质的浓度，了解每种测定方法的原理及特点，有助于选择出合适的测定方法。
三、实验材料、仪器及试剂
1．实验材料
1菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）。
2培养基配制如下。
Luria-Bertani LB液体培养基1 L：950 mL去离子水中加入10 g胰蛋白胨5 g酵母提取物和10 g NaCI，溶解后调节pH至7.0，加水定容至1L，1210C高压蒸汽灭菌20 min。
LB同体培养基IL：1 LLB液体培养基中加入琼脂20 9，121℃高压蒸汽火菌20 min。
2．仪器及器皿
1收集细胞、计数及测细胞T重：试管、移液器、量筒、离心管、坩埚，血球计数板、分析天甲、离心机、烘箱、干燥器等。
2测定细胞蛋白质含量：试管、比色管、移液器、离心管、离心机、量筒、水浴锅、721（或722）分光光度计等。
3．试剂
1收集细胞、计数、测定细胞干重：甲醛、生理盐水、去离子水。
2细胞蛋白质含量测定——福林．酚法：1 molL NaOH、2molL NaOH、生理
盐水、10 mgmL牛血清白蛋白溶液、福林一酚试剂甲、福林一酚试剂乙。
福林．酚试剂的配制（均用分析纯试剂）如下。
试剂甲：①4% NaC03；②0.2 molL NaOH;③l% CuS04;④2%洒石酸钾钠溶液。
在使用前，将①与②等体积混合配成NaC03-NaOH溶液，将③与④等体积混合配成CuS04-酒石酸钾钠溶液，然后将这两种溶液按50：1的比例混合，即为福林一酚试剂甲，该试剂只能用一天，过期无效。
试剂乙：在2L的磨口同流装置内加入100 9 Na2W04-2H20，25 9 Na2M004-2H20，，700 mL去离子水，再加入50 rriL H3P04及100 mL浓HCI，允分混匀使其溶解后，以小火回流lOh（烧瓶内加数颗小玻璃珠，以防溶液溢出）；再加入150 9 Li2S04．50 mL去离子水及数滴液溴；然后在通风橱中开口继续沸腾15 min，以便除去过黾的溴；冷却后定容到IL;过滤，滤液黄色，置棕色试剂瓶中冰箱保存。若此储存液放置时间过长，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，即可恢复原来颜色，仍可继续使用。
乙试剂储存液在使用前应确定其酸度。用它滴定1 molL标准NaOH溶液，以酞为指示剂，当溶液颜色由红紫-紫狄-墨绿时，即为滴定终点。该储存液的酸度应为2 molL左右，将其稀释为约1 molL酸度，即为福林一酚试剂乙液。
3蛋白质含量测定——考马斯亮蓝染色法：100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用去离子水稀释至1000 mL，滤纸过滤。考马斯亮蓝G-250的终浓度为0.Ol%（聊／矿），乙醇的终浓度为4.7%（聊／矿），磷酸的终浓度为8.5%rriV。
四、操作步骤
（一）测定细胞干重
1．活化菌株，收集细胞
1将E．coli接种于LB斜而上，37℃
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