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| 編輯推薦： |
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《生物化学分析技术实验教程》适合应用于高等院校生命科学、生物技术类本科生及研究生的实验教学,并可应用于生物制药、食品、药品、医学、临床检验、环境监测等学科的本科生及研究生进行实验教学,亦可以作为相关生物制药企业等社会研究和应用部门的实验技术参考书.
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| 內容簡介： |
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《生物化学分析技术实验教程》主要介绍在当前生命科学研究、应用和生产领域内对天然及基因重组生物分子的分离、纯化、制备、分析、鉴定、数据处理等多方面生化分析的技术原理、实验方法、实验操作、实验设计,以及相关生化仪器的使用,涵盖了当前在蛋白质化学、蛋白质组学及生物工程下游技术中所应用的大多数层析、电泳等实验方法.《生物化学分析技术实验教程》步骤描述具体细致、实验过程系统完整,实验装置可精可简,《生物化学分析技术实验教程》图文并举、数据优化详尽,具有较强的指导性和可操作性.《生物化学分析技术实验教程》的内容分为基础实验部分和综合实验部分,实验内容可以根据相关本科生及研究生的不同层次和基础,以及不同实验室条件和应用需求进行选择性教学,其实验教学的主要方式是在着重学生基本实验操作技能训练的基础上开展综合性大实验训练.
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| 目錄：
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前言
基础实验部分
实验1紫外分光光度法（测定蛋白质吸收光谱曲线及含量）
实验2荧光光度测定法（测定核黄素含量）
实验3离子交换柱层析（分离氨基酸）
实验4凝胶层析（分离蛋白质及相对分子质量测定）
实验5DEAEG纤维素梯度洗脱柱层析
实验6疏水层析
实验7亲和层析分离纯化胰蛋白酶（环氧氯丙烷活化法）
实验8亲和层析分离纯化胰蛋白酶抑制剂（溴化氰活化法）
实验9金属螯合柱层析
实验10反相层析
实验11聚焦层析
实验12吸附层析（羟基磷灰石柱层析分离纯化DNA）
实验13单向火箭免疫电泳
实验14聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳和圆盘电泳
实验15SDSG聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳（不连续体系）
实验16SDSG聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（连续体系）
实验17TricineGSDSG聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离小分子多肽）
实验18管式凝胶等电聚焦
实验19水平平板凝胶等电聚焦
实验20U形管密度梯度等电聚焦
实验21潜水式琼脂糖凝胶电泳
实验22梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验23印迹转移电泳
实验24酶联免疫吸附测定
综合实验部分
实验25蔗糖酶的综合分离纯化及其性质鉴定
实验26人绒毛膜促性腺激素的综合分离纯化及其性质鉴定
实验27α-淀粉酶的综合分离纯化及其性质鉴定
实验28亲和层析分离纯化尿激酶及其性质鉴定（溴化氰活化法）
实验29双向电泳（双向电泳比较FADD和FADD--细胞株的蛋白质表达差异）
实验30脉冲场凝胶电泳
实验31毛细管电泳
实验32基因融合蛋白质的纯化
附录
附录A聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质银染色法
附录B常用缓冲液的配制方法
附录C常用数据
参考文献
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| 內容試閱：
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实验目的与要求
（1）了解紫外-可见分光光度计的测定原理和使用方法。
（2）学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。
（3）学习和掌握蛋白质的定性？定量测定方法。
实验原理
蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（如酪氨酸？色氨酸？苯丙氨酸）具有共轭双键结构能够产生π→π﹡ 及n→π﹡ 类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行辅助定性分析。根据Beer定律，当光径一定时，蛋白质溶液在280nm波长处的光吸收，在一定范围内与其浓度呈正比关系，可以进行定量测定。
实验仪器与器材
1. 实验仪器
紫外-可见分光光度计；混合器；电子天平。
2. 实验器材
可调取液器；试管；试管架；吸管；吸管架；烧杯；滴管；容量瓶；洗耳球；剪
刀；玻棒；骨勺；称量纸；吸水纸；洗瓶；标签纸。
试剂及配制
1. 实验试剂
①牛血清白蛋白标准品；②牛血清白蛋白测试品。
2. 试剂配制
（1）牛血清白蛋白标准品溶液（1.0mgml）：准确称取牛血清白蛋白标准品50.0mg，置于50ml容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即为浓度1.0mgml的标准品溶液。
（2）牛血清白蛋白测试品溶液（1.0mgml）：准确称取牛血清白蛋白测试品50.0mg，置于50ml容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即浓度为1.0mgml的测试品溶液。
实验步骤
1. 蛋白质的紫外吸收光谱曲线测定与制作
1）蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定
取2只光径为1.0cm洁净的石英比色杯，分别倒入4ml蒸馏水和4ml牛血清白蛋白标准品（或测试品）溶液，在测定波长处以蒸馏水为空白溶液（即参比溶液），调节紫外-分光光度计的光吸收零点。样品溶液在250~300nm波长的范围内，每间隔5nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的光吸收。在每次更换测定波长时，均需要重新用空白溶液调节仪器的光吸收零点后，方能再测定样品溶液。对测定波长的范围和间隔大小，亦可根据不同样品的情况和要求加以确定（加大或缩小间隔）。
注：如果被测样品的溶剂不是蒸馏水，则应用相应样品的溶剂作为空白溶液。
2）蛋白质的紫外吸收光谱曲线（A-λ）的制作
以测定的波长λ为横坐标，相应的光吸收A 为纵坐标对应作图。将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线（A-λ），其中最大吸收峰值所对应的波长即为该蛋白质最大吸收波长λmax。
注：蛋白质或其他生物分子的吸收光谱，亦可用具有自动连续波长扫描的双光束可见-紫外分光光度计进行自动测定，通过记录仪或计算机记录所测定的吸收光谱。
对于采用双光束可见-紫外分光光度计进行自动测定时，首先需要在两个同样的比色杯中装入相同的空白溶液，分别插入参比（reference）光路和样品（sample）光路，在扫描波长起点处调节好光吸收零点后，再在样品光路换入被测定样品溶液（参比光路的空白溶液仍保留其中），进行所确定波长范围的吸收光谱自动扫描。
2. 蛋白质的紫外分光光度法含量测定
1）牛血清白蛋白标准品溶液的配制
将已配好的牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液（浓度为1.0mgml），按表1-1稀释成6种不同浓度的标准品溶液。
表1-1 不同浓度的BSA 标准品溶液配制表
2）牛血清白蛋白测试样品溶液的配制
将未知含量的BSA测试样品按估计含量，用蒸馏水稀释配制成在标准曲线范围内的浓度，估计浓度应尽量接近标准曲线中间点的浓度。如果测试样品估计浓度超出（低或高于）标准曲线范围，需重新调整配制。
3）标准品溶液及测试样品溶液的测定
用紫外分光光度计在280nm波长处，以蒸馏水（或相应样品的溶剂）为空白溶液调节仪器光吸收零点，然后分别依次测定标准品溶液（浓度从低到高）和测试样品溶液的光吸收A。
4）A-C标准曲线的制作
（1）以所测得的标准品溶液光吸收A 为纵坐标，相应已知的标准品含量C为横坐标对应作图，既得标准品溶液光吸收和含量（A -C）的标准曲线。
（2）通过被测试样品的光吸收在标准曲线上查出相应蛋白质含量。
A-C 标准曲线亦可用Excel线性回归作图进行测定。
注：该定量方法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
思考题
1. 蛋白质的特征紫外吸收波长一般为280nm，多肽的特征紫外吸收波长为多少?
核酸的特征紫外吸收波长为多少?
2. 在吸收光谱测定中，为何在每次更换测定波长时均需要重新用空白溶液调节仪器的光吸收零点后再测定样品溶液?
注：双光束紫外-可见分光光度计进行自动吸收光谱测定时是将空白溶液保留在参比光路中进行测定来解决该问题的。
3. 在定量测定中，为何测试样品估计浓度超出（低于或高于）标准曲线范围需重新配制调整浓度（或利用Lambert定律改变比色杯厚度）到标准曲线范围内?
4. 如何计算测定样品的百分消光系数和摩尔消光系数?
附注：
几种标准蛋白质的光吸收参数见表1-2。
表1-2 几种标准蛋白质的光吸收参数
实验目的与要求
（1）通过对核黄素的含量测定，了解荧光光度法测定的原理。
（2）学习荧光光度计的操作和使用。
（3）掌握荧光光度法定量分析的方法。
实验原理
核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，在水和乙醇等中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢核黄素，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢核黄素在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如图2-1所示。
图2-1 核黄素的氧化还原
核黄素激发光波长范围为440~500nm （一般规定为440nm），发射光波长范围为510~550nm （一般规定为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度呈正比，根据还原前后的荧光差数可以进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。
实验仪器与器材
1. 实验仪器
荧光光度计；磁力搅拌器；电子天平；水浴锅；混合器。
2. 实验器材
可调取液器；试管；试管架；吸管；吸管架；容量瓶；烧杯；量筒；滴管；镊子； 剪刀；玻棒；骨勺；称量纸；吸水纸；吸耳球；记号笔或标签纸。
试剂及配制
1. 实验试剂
①连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠；②核黄素；③乙酸。
2. 试剂配制
（1）连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠，直接用。
（2）36% 醋酸溶液：取乙酸36.0ml，用蒸馏水稀释至100.0ml，混匀即可。
（3）核黄素标准品溶液（10.0μgml）：准确称取核黄素10.0mg，放入预先装有少量蒸馏水（约50ml）的1000.0ml容量瓶中，加入5.0ml36% 乙酸溶液，再加约800ml蒸馏水，置50℃水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，再用蒸馏水定容至1000.0ml，混匀即可。
注：在所有操作过程中，要避免核黄素受阳光（或强光）直接照射，配制好的核黄素溶液需避光保存。
实验步骤
1. 核黄素标准品溶液的配制
用已配制的核黄素标准品溶液（10.0μgml），按表2-1再稀释成6种不同浓度。
表2-1 核黄素标准品溶液配制表
2. 核黄素样品溶液的配制
将被测试的核黄素样品参照标准品溶液的含量范围和溶剂体系配成测定溶液（测定食物和生物材料中的核黄素，一般需要事先经过抽提，或分离？纯化处理后，方可测定）。
3. 荧光测定
1）选用滤色片
参照930型荧光光度计的使用说明，选用滤色片。核黄素荧光测定的激发光波长为455nm，发射光（荧光）波长为523nm。因此，可选用带通型400nm（蓝字）滤色片为激发光滤色片，选用截止型510nm （红字）滤色片为发射光滤色片，同时启动仪器进
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