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《羊草种质资源研究（第二卷）》对于从事羊草和其他乡土草种质资源和基因资源研究的科研工作者具有重要的参考价值，对于草地管理及优质饲草开发从业人员具有重要实用价值。
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| 內容簡介： |
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羊草是欧亚大陆东部广泛分布的多年生草本植物，是我国北方草原生态环境保护的关键乡土草种，也是草食家畜的优质饲草。我国对羊草有着系统的研究，资源优势明显。《羊草种质资源研究（第二卷）》著者及其团队在出版《羊草种质资源研究》（**卷）的基础上，对近5年微观领域的**研发成果进行了系统性整理，撰写了《羊草种质资源研究》（第二卷），本卷的特色在于：采用新一代测序技术对羊草进行转录组高通量深度测序，建立了国际上首个羊草基因资源信息平台；基于羊草基因数据库，从分子水平上深入研究了羊草耐牧等关键科学问题，并克隆和验证了一批羊草特异的新基因。《羊草种质资源研究（第二卷）》共分十一章，内容包括：羊草转录组测序及数据库建设、羊草刈割相关基因表达谱分析、羊草刈割伤口对BSA的响应、羊草DREB家族基因功能研究、羊草WRKY家族基因结构和功能分析、羊草新功能基因的克隆及功能研究、羊草对除草剂的抗性研究、羊草对水分的响应规律分析、羊草的水肥需求特性研究、羊草有性生殖研究进展、施肥对羊草种子产量的影响。
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| 目錄：
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**章 羊草转录组测序及数据库建设1
引言1
**节 研究材料、关键技术和方法2
第二节 研究取得的重要进展4
第三节 研究结论与讨论18
第四节 小结与展望19
参考文献20
第二章 羊草刈割相关基因表达谱分析22
引言22
**节 研究材料、关键技术和方法23
第二节 研究取得的重要进展25
第三节 研究结论与讨论33
第四节 小结与展望35
参考文献35
第三章 羊草刈割伤口对BSA的响应38
引言38
**节 研究材料、关键技术和方法46
第二节 研究取得的重要进展52
第三节 研究结论与讨论67
第四节 小结与展望71
参考文献72
第四章 羊草DREB家族基因功能研究79
引言79
**节 研究材料、关键技术和方法80
第二节 研究取得的重要进展90
第三节 研究结果与讨论97
第四节 小结与展望106
参考文献106
第五章 羊草WRKY家族基因结构和功能分析109
引言109
**节 研究材料、关键技术和方法112
第二节 研究取得的重要进展123
第三节 研究结论与讨论133
第四节 小结与展望136
参考文献137
第六章 羊草新功能基因的克隆及功能研究140
引言141
**节 研究材料、关键技术和方法143
第二节 研究取得的重要进展151
第三节 研究结论与讨论173
第四节 小结与展望176
参考文献177
第七章 羊草对除草剂的抗性研究182
引言182
**节 研究材料、关键技术和方法184
第二节 研究取得的重要进展190
第三节 研究结论与讨论198
第四节 小结与展望199
参考文献199
第八章 羊草对水分的响应规律分析201
引言201
**节 羊草群落蒸腾蒸散的变化规律201
第二节 羊草群落对水分的需求规律203
第三节 水分对羊草生长的影响204
第四节 小结与展望205
参考文献205
第九章 羊草的水肥需求特性研究207
引言207
**节 研究材料、关键技术和方法208
第二节 研究取得的重要进展211
第三节 研究结论与讨论225
第四节 小结与展望226
参考文献227
第十章 羊草有性生殖研究进展229
引言229
**节 羊草有性生殖器官的形成及发育230
第二节 羊草有性生殖过程232
第三节 羊草种子的形成及结实234
第四节 羊草种子特性235
第五节 小结与展望237
参考文献237
第十一章 施肥对羊草种子产量的影响240
引言240
**节 研究材料、关键技术和方法241
第二节 研究取得的重要进展242
第三节 研究结论与讨论250
第四节 小结与展望251
参考文献251
后记253
研究工作照片
彩图
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**章 羊草转录组测序及数据库建设
摘要 羊草为异源四倍体（2n=4x=28）植物，基因组较大，约为10 Gb且杂合性较高。新一代测序技术的出现及快速发展为研究羊草这样一种基因组信息几乎为零的非模式植物提供了新的思路。近年来刘公社研究团队采用新一代454高通量测序技术对5个不同时期、不同组织和不同处理的样品进行了全转录组测序，采用Newbler 2.5组装得到87 214条Unigene序列。通过对测序得到的87 214条Unigene与NR蛋白库和Uniprot蛋白库比对注释了54 584个基因；通过对差异表达基因分析找到了3024个冷响应的基因；SSR分析鉴定出3597个包含EST-SSR的基因。通过对羊草特异基因和禾本科特异基因的查找，共鉴定出19 954个禾本科特异的基因和12 811个羊草特异的基因；进化分析表明羊草在进化上与大麦和小麦的亲缘关系更近。此外，根据生物信息学分析的结果，构建了首个羊草转录组数据库，该数据库网站收集了952 328条EST序列、32 416条Contig序列、118 860条Singleton序列以及其他转录组数据分析的结果，提供了在线比对、序列下载、查找等功能，极大地丰富了羊草基因资源数据，为羊草优异基因的挖掘奠定了基础。
关键词 羊草；454高通量测序；转录组；数据库；基因资源
引言
羊草[Leymus chinensis（Trin.）Tzvel]作为一种兼具经济价值和生态价值的重要的禾本科牧草，近十年来，国内外研究者已经意识到挖掘羊草基因资源的重要性和迫切性。韩国的Jin等（2006）采集自然生长的植物叶组织经过Na2CO3胁迫处理构建cDNA文库，并对羊草998个cDNA克隆进行测序，得到了叶组织的869条EST和根组织的773条EST。我国研究者利用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization，SSH）构建羊草盐碱胁迫消减文库，通过测序得到了1920条序列，并获得了与盐碱胁迫相关的基因，如单脱氢抗坏血酸还原酶（MDAR）和脱水素（dehydrin）基因等（解莉楠等，2007）。孔祥军等（2008）通过运用DDRT-PCR技术，从Na2CO3胁迫处理的羊草幼苗中分离到22个差异表达的基因片段。王丽娟等（2009）采用SMART技术，构建了高质量的cDNA文库测序得到了285条EST，通过筛选得到117条非重复基因序列。上述的研究都采用了传统的测序手段，然而传统的测序方法由于价格昂贵、通量小，所获得的EST数量非常有限。
自454 Life Sciences公司首次推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统以来，高通量测序技术迅速在生命科学研究的各个领域得到了极其广泛的应用。对基因组测序来讲，太大的基因组（10 Gb）超出了目前De novo组装基因组软件对其内存的要求，客观条件上无法实现组装。杂合度对基因组组装的影响主要体现在不能合并姐妹染色体，从而造成组装后基因组大小较实际的基因组偏大。一般认为如果杂合度高于0.5%时组装有一定的难度，杂合度高于1%则很难组装出来。羊草是异源四倍体植物，共有28条染色体，基因组大小约10 Gb且杂合度较高，其基因组的公式是NsNsXmXm，其中Ns来自新麦草属，而第二个基因组Xm的起源尚未确定（Vogel et al.，1999；Sun et al.，1995；B dvarsdóttir and Anamthwat-Jónsson，2003；Liu et al.，2008）。过大的基因组和较高的杂合度使羊草基因组的组装变得非常困难，同时价格昂贵。因此，转录组测序技术为研究羊草这样一种基因组信息几乎为零的非模式植物提供了新的思路。吉林农业大学研究人员利用454测序技术，对盐碱胁迫处理后的羊草材料进行了测序，获得了大量的盐碱胁迫相关的基因EST序列（Sun et al.，2013）。
目前，已有很多专门针对一个物种基因组的网站，植物领域常用的有TAIR和RGAP，而物种转录组的网站则更加普及（D′Agostino et al.，2007；Grafahrend-Belau et al.，2008；Kim et al.，2008；2009；Dauchot et al.，2009；Maheswari et al.，2009）。已有研究人员利用**代的测序技术对羊草进行转录组测序并获得了一些EST序列，但与其他作物种和模式植物相比，NCBI数据库中羊草基因资源信息非常少，羊草基因数据库也未见报道。本章研究采用454高通量测序技术通过生物信息学的手段挖掘大量羊草基因资源，并对基因序列深入分析，构建首个羊草基因信息数据库，为羊草这一重要物种的研究提供丰富的基因信息资源，也为今后羊草分子生物学相关研究奠定基础。
**节 研究材料、关键技术和方法
一、研 究 材 料
454测序选取的羊草材料是刘公社实验室研发的‘中科2号’羊草品种。该研究中共选取了5种不同的羊草样品进行测序。具体包括：
（1）在田间自然低温驯化后，进行-40℃低温胁迫处理的羊草芽样品。
（2）在田间自然低温驯化的羊草芽样品（温度为-15℃左右）。
（3）在温室25℃左右培养出的生长旺盛的羊草的芽样品，作为对照材料。
（4）温室25℃左右培养的不同时期、不同组织的羊草混合样。
（5）温室25℃左右培养的羊草的幼穗。
将上述样品迅速取材后，用锡箔纸包裹，投入液氮中，-80℃超低温冰箱保存。
二、关键技术和方法
（一）羊草总RNA提取
对上述5种不同的羊草样品，采用Trizol法进行总RNA的提取，方法如下：
（1）取100 mg样品于液氮中迅速研磨成粉末（研钵预先用液氮预冷），立刻加入1 mL Trizol试剂，充分混匀，转移到1.5 mL RNase free的离心管中；
（2）室温静置5 min后，加入500 μL苯酚氯仿异戊醇（体积比为25∶24∶1，pH4.5），剧烈振荡15 s，室温放置3 min；
（3）4℃，12 000 rmin离心10~15 min，样品分成3层，RNA主要在上层的水相中，转移水相到新的离心管中；
（4）在得到的水相溶液中加入200 μL新鲜氯仿，剧烈振荡，室温放置2~3 min；
（5）4℃，12 000 rmin离心10 min；
（6）将水相转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，混匀，室温放置10 min；
（7）4℃，12 000 rmin离心10 min，弃上清。
（8）加入1 mL 70%冰乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，4℃，12 000 rmin
离心5 min重复一次；
（9）小心弃去乙醇，沉淀在室温晾干或真空干燥5~10 min（RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解）；
（10）加入80 μL DEPC处理的双蒸水，溶解RNA（可选55~60℃温育10 min）；
（11）电泳检测，并测OD值定量RNA浓度。
（二）454测序流程
对羊草5个不同的组织和处理的样品构建5个转录组测序文库。采用454测序平台对5个文库进行单端测序，文库1和5采用的是GS FLX的普通试剂进行测序，其他文库采用的是GS FLX Titanium（钛试剂）进行测序。
454测序的基本原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。
454测序的流程：
（1）文库的制备：基因组DNAcDNA片段化处理至300~800 bp，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA。
（2）乳液PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片段在各自的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化。
（3）测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。
（4）数据分析：GS FLX系统在10 h的运行中可获得100余万个读长，读取超过4亿个碱基信息。
数据分析的基本流程：
经过454高通量测序仪得到原始reads后，首先对原始数据进行去低质量、去叶绿体、去线粒体等，然后得到clean reads，通过clean reads进行De novo组装得到转录组的Unigene，在Unigene的基础上开展后续的分析，如基因功能注释、差异基因的鉴定、富集分析、SSR分析，等等。
第二节 研究取得的重要进展
一、原始数据的统计
通过454测序平台对5个文库进行单端测序得到1 051 550个reads，经过去除接头、低质量reads、叶绿体和线粒体后共得到952 328条高质量的reads。文库1和文库5中高质量reads的平均长度分别为249 bp和282 bp，其他3个文库中高质量reads的平均长度为340 bp左右（表1.1）。
表1.1 羊草454转录组测序reads数据和质量过滤
对测序得到的952 328条高质量reads进行分析，平均长度为300 bp，*长的read 641 bp，*短的read 60 bp，reads的中位值是296 bp。以25 bp为长度区间对reads进行了统计，结果表明reads的长度分布比较均匀且绝大多数的长度都在200 bp以上，226~250 bp长度段的reads数目*多（图1.1）。
二、组装结果统计
前期，对当前组装软件的组装结果进行比较，选取了Newbler 2.5的组装结果进行后续的分析。在Newbler v2.5的结果中共获得87 214条Unigene（分别包括长度大于100 bp的32 416条Contig和长度大于300 bp的54 793条Singleton）。此外，通过与微生物的蛋白库做比对发现仅有不到0.01%的序列能获得有意义的匹配，说明本研究样品没有受到微生物的污染。对组装获得的Contig和Singleton按每100 bp为一个长度段进行分类统计，长度分布情况如图1.2所示。
三、功能注释
通过对羊草Unigene和已知的数据库进行相似性的搜索找到*相似的基因，并根据相似已知基因的功能对Unigene进行功能注释。Unigene功能注释的过程包括：首先通过EMOSS（Rice et al.，2000）包中的GetORF软件来预测所有基因的ORF并翻译出每个基因所编码的蛋白质，然后利用基因的编码蛋白与UniProt库进行比对，如果有相似的序列则根据相似的序列进行注释，如果没有相似序列将与NCBI的非冗余数据库（nr）进行序列比对注释。通过对87 214个Unigene进行比对注释，共有54 584（62.6%）条Unigene序列被注释，BLAST的参数设置为e≤1×10-3。
（一）GO注释和分类
GO（gene ontology）是用一套具有动态形式的控制字汇来解释真核生物的基因或蛋白质在细胞内所扮演的角色及医学方面的知识，同时这些字汇随着生命科学研究的进步，一直不断地累积与改变（Ashburner et al.，2000）。采用Gopipe软件对87 214个Unigene进行注释，发现共有17 463个Unigene对应89 129个GO的编号。其中，有31 986个GO编号是对应生物过程，22 863个GO编号属于细胞组成类，34 279个GO编号对应于分子功能。通过在线软件WEGO对所有具有GO注释的Unigene进行GO分类统计。在细胞组成中主要的GO功能有细胞（cell）、细胞组分（cell part）、细胞器（organelle）；在分子功能中主要的GO功能有结合（binding）和催化剂（catalytic）；
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